Mise à jour:

27 jui 07

Site internet d'introduction aux techniques utilisées en biochimie

AUTORADIOGRAPHIE ET FLUOROGRAPHIE

 

Les isotopes sont couramment employés en biochimie pour marquer des molécules, suivre des réactions, etc. En particulier, il est souvent souhaitable de localiser la présence de ces molécules marquées à un endroit précis: sur un gel d'électrophorèse, dans un tissu ou une cellule, etc. Les formes les plus fréquentes de ce type de détection qualitative sont l'autoradiographie et la fluorographie.

 

PRINCIPES THÉORIQUES

Autoradiographie

L'autoradiographie est une méthode permettant la détection qualitative de matériel radioactif fixé sur un substrat solide: gel de polyacrylamide, feuille de nitrocellulose, plaque de chromatographie sur couche mince, etc. Cette matrice peut alors être mise en contact avec un film (généralement à rayons X). Les radiations émises. particules b ou rayons g, impressionneront alors le film vis-à-vis leur lieu d'émission. Le développement subséquent du film permettra de localiser le ou les endroits où est situé le traceur radioactif.

Les objets qu'on peut ainsi soumettre à l'autoradiographie sont de divers types: gels d'acrylamide ou d'agarose, feuilles de nitrocellulose, coupes de tissus, etc. L'autoradiographie a même été initialement développée par J. Leblond (McGill University) pour étudier l'absorbtion de nutriments par l'organisme: il autoradiographiait des coupes d'animaux entiers!

Cette approche peut aussi être appliquée au niveau microscopique. Dans ce cas, les films traditionnels (émulsion photographique sur un support solide) sont moins facilement utilisables. On emploie plutôt des émulsions photographiques qu'on dépose directement sur des coupes histologiques.

 

Fluorographie

Une technique similaire à l'autoradiographie est utilisée pour les émetteurs b faibles (tritium) ou moyens (carbone-14 et souffre-35): la fluorographie. Dans ce cas, la matrice est préalablement imprégnée d'une substance de type scintillant primaire utilisée pour le comptage en milieu liquide (e.g. du P.O.P.). Les particules b ou g généreront des photons lumineux qui eux impressionneront le film.

 

Formation de l'image

Dans ces deux techniques l'image est formée selon les mêmes principes que dans une photographie conventionelle. Brièvement, de l'énergie est absorbée par des grains d'halogénure d'argent en suspension dans une émulsion de gélatine. La réduction de l'halogénure cause l'émission d'électrons qui seront trappés par des points sensibles à la surface ou à l'intérieur de l'émulsion. Les ions d'argent, chargés positivement, seront attirés par les points sensibles et se combineront pour donner de l'argent colloïdal métallique. Ce point sensible s'amplifiera et se stabilisera au fur et à mesure que d'autres atomes ionisés d'argent viendront s'agglomérer pour former un noyau réactionnel (de 4 à 6 sont nécessaires). Une image latente, invisible à l'oeil nu, se sera formée sur le film selon la position des sources énergétiques (lumière, rayonnement b).

L'image latente ainsi formée pourra être rendue visible par des procédures de développement et de fixation typique de la photographie. Le développeur sert à réduire l'halogénure d'argent en argent métallique autour du noyau réactionnel constituant l'image latente. Cela amplifie cette dernière des milliards de fois pour former une image visible. Après un rinçage à l'eau pour éliminer le développeur et éviter un sur-développement de l'image, on dissout l'halogénure d'argent résiduel avec le fixateur.


MÉTHODOLOGIE ET APPAREILLAGE

On utilise généralement des films à rayon X pour l'autoradiographie ou la fluorographie. Cependant, beaucoup de compagnies ont développé des films mieux adaptés, plus sensibles, aux rayonnement de faible intensité comme celui du tritium.

Pré-exposition

Pour accentuer la sensibilité des films lors d'une exposition de très petites quantités de radioactivité ou à un isotope très faible, on a quelques fois recourt à une pré-exposition ("pre-flashing"). Il s'agit simplement de soumettre le film, avant l'exposition au radio-isotope, à un très court flash de lumière (environ 1 msec). Ceci initie la formation de très petits agglomérats d'argent colloïdal, 1 à 3 atomes, de "gros" points sensibles. Cela facilitera la formation de l'image latente avec peu de lumière ou de particules b.. Cette technique a cependant l'inconvénient d'augmenter le bruit de fond.

Ecran d'intensification

Les isotopes très puissants, comme le 32P, on souvent l'inconvénient inverse des isotopes très faibles. Ils passent à travers le film sans affecter l'émulsion photographique, ce qui les rend difficiles à détecter. Pour résoudre ce problème, on emploie des écrans d'intensification. Ces écrans sont généralement faits de tungtène et sont disposés de l'autre coté du film. De sorte que le rayonnement qui traverse le film sans s'arrêter va "rebondir" sur l'écran et traverser de nouveau le film. Lors de ce deuxième passage, les particules b, énergétiqement affaiblies, ont beaucoup plus de chance d'amorcer un processus de formation d'image. Dans certains cas extrèmes, on peut utiliser deux écrans, un de l'autre coté du film et un derrière le gel. Ce dernier fera rebondir les radiations qui n'ont pas été arrêtées par leur deuxième passage. L'inconvénient des écrans d'intensification est qu'ils diminuent la résolution de l'image à cause de la dispersion des radiations au fur et à mesure de leurs rebonds sur l'écran.

APPLICATIONS À LA BIOCHIMIE

Localisation des protéines ou des acides nucléiques dans un gel d'électrophorèse

La façon la plus efficace d'étudier les protéines synthétisées suite à une stimulation donnée est de procéder par marquage métabolique avec présence d'acides aminés radioactifs. Les plus utilisés sont la méthionine-35S, qui peut être obtenue à de très fortes activités spécifiques, et la leucine tritiée. Les réactions de phosphorylation de protéines peuvent être étudiées avec de l'ATP dont le phosphore-g est marqué. La synthèse et la composition des acides nucléiques sont aussi fréquemment étudiées de cette façon avec des nucléotides marqués comme traceurs. Pour des raisons de sécurité, on peut utiliser des dérivés nucléotidiques où le phosphore-a a été remplacé par un atome de souffre radioactif, 35S moins dangereux que le 32P.


Création: 98 07 11

Additions: 00 07 17

Modifications minueures: 00 07 27

04 02 25

 

RÉFÉRENCES ET BIBLIOGRAPHIE

RF Boyer (1986) Modern experimental biochemistry, Addison-Wesley Publishing Co, Reading (Mass., USA), p.185-6. [très brève discussion de l'autoradiographie]

RMC Dawson, DC Elliot, WH Elliot, KM Jones (1986) Data for biochemical research, Clarendon Press, Oxford, p.530. [formule mathématique pour les quantités de radio-isotopes pour obtenir une réponse visible]

RL Dryer, GF Lata (1989) Experimental Biochemistry, Oxford University Press, New York.

EJ Hahn (1983) Autoradiography - A Review of Basic Principles, Amer Lab 5:64-71.[bonne description des principes de base de l'autoradiographie, particulièrement la formation de l'image, les écrans d'intensification, etc.]

P Kamoun (1987) Appareils et méthodes en biochimie, 3e édition, Flammarion Médecine-Sciences, Paris, p. 126-7.

RA Laskey (1980) The Use of Intensifying Screens or Organic Scintillators for Visualizing Radiactive Molecules Resolved by Gel Electrophoresis, Meth Enzymol 65:363-371.

DT Plummer (1987) An Introduction to Practical Biochemistry (3° éd.) McGraw-Hill, London.

JH Waterborg, HR Matthews (1984) Fluorography of gels containing tritium in Methods of molecular biology, vol 2 (JM Walker, éd.), pp 147-152, Humana Press, Clifton (Ma, USA)

K Wilson, J Walker (1994) Principles and techniques of practical biochemistry (4e éd) Cambridge University Press. Oxford.

©

Didier Gauthier

 

Table des matières du SITUUB

Page de Didier Gauthier

Questions?