Mise à jour:

24 sep  2009

 Introduction aux techniques utilisées en biochimie

ISOLEMENT ET PURIFICATION DES PROTÉINES

 

 

La purification d'une protéine est un processus qui prend plusieurs étapes: extraction initiale, précipitation différentielle, dialyse, chromatographies de divers types, etc.

PRINCIPES THÉORIQUES

Principales étapes d'une purification

Typiquement, on broie tout d'abord le matériel d'où on veut extraire la protéine (tissu animal, partie de plantes, bactéries, etc). Divers appareils ("Waring Blender", appareil Potter-Eveljhem, "Polytron", etc.) peuvent être employés à cette fin. Cette homogénéisation se fait dans un tampon de composition appropriée. Cette étape est évidemment la première.

L'homogénat ainsi obtenu est ensuite clarifié, le plus souvent par centrifugation, pour éliminer les grosses particules peu ou mal broyées ou encore pour obtenir la fraction cellulaire contenant la protéine recherchée. Si la protéine est justement dans un compartiment cellulaire, on utilise généralement un détergent doux (Triton, Tween, etc., quelquefois déoxycholate) pour la libérer en dissolvant les membranes de ce compartiment. L'emploi de détergent doit souvent être fait de façon controlée car ils peuvent briser les lysosomes, ce qui libèrent des enzymes hydrolytiques (protéases, nucléases, etc) qui peuvent attaquer et détruire les protéines ou autres molécules qu'on veut isoler. Des précautions particulières  doivent être prises si on travaille avec des protéines sensibles à la dégradation ou peu nombreuses. Certains tissus comme le pancréas et de foie sont reconnus pour contenir de grandes quantités de ces enzymes, ce qui pose tout un défi quand on travaille avec ces tissus. Une solution fréquente à ce problème est l'inclusion dans les solutions d'inhibiteurs de protéases qui sont soit physiologiques (inhibiteur de trypsine, antipaïne. leupeptine...)  ou artificiels (E64, PMSF...). Pour maximiser leur action, on les emploie souvent en mélange ("cocktails") à large spectre d'action.

Ensuite on utilise diverses techniques pour séparer la protéine recherchée de toutes les autres présentes. Habituellement les premières étapes sont des techniques peu spécifiques mais bien adaptées à la manipulation de gros volumes. Ensuite, au fur et à mesure des étapes, on utilise des techniques de plus en plus spécifiques qui sont souvent applicables à des préparations de volume réduit.

Une des méthodes se prêtant le mieux à de gros volumes est la précipitation différentielle au sulfate d'ammonium. C'est pourquoi on l'utilise très souvent immédiatement après l'homogénéisation pour se débarrasser du gros des contaminants.

Les chromatographies d'échange ionique ou les chromatographies d`affinité, applicables à de bons volumes d'échantillon mais ayant un assez bon pouvoir de séparation, constituent de bonnes méthodes intermédiaires.

En finale, on utilise souvent le tamisage moléculaire ou l'isofocalisation qui permettent de raffiner la pureté, mais nécessitent de très petits volumes de protéines concentrées.

Souvent, entre ces étapes, il faut éliminer les sels ou produits utilisés dans ces chromatographies. On utilise alors une dialyse ou une ultrafiltration. Si on a besoin de concentrer la préparation, on la lyophilise. Si on veut éviter ces procédures, on doit choisir des méthodes qui ne sont pas affectées négativement par ces produits.

Dosage des protéines et dosage de l'activité des protéines

Toutes ces étapes doivent être suivies de près pour vérifier si les techniques fonctionnent bien. Pour cela, il est très courant de doser la protéine à purifier après chaque étape. Il faut donc posséder une méthode de dosage (enzymatique, immunologique, biologique, etc.) pour suivre le processus. On mesure aussi la quantité totale de protéines. Cette dernière valeur servira à calculer l'activité spécifique (voir tableau de purification)

Dans le cas où il s'agit de la première fois que la protéine est isolée, il faudra développer la méthode de dosage avant même de développer la méthode de purification.

Tableau de purification et critères de pureté

Durant toutes ces étapes, il est essentiel d'évaluer les deux facteurs clef, pureté et rendement. Le rendement (la quantité de protéine obtenue) peut facilement être mesurée par dosage enzymatique, RIA, etc. Un tableau de purification (voir section "calculs") est aussi un outil très utile à cette fin. Si on s'aperçoit qu'une des étapes de purification provoque une perte substantielle d'activité ou de quantité de la protéine, on doit remettre en question son utilité ou la qualité de son exécution. L'activité spécifique est une mesure quantitative de la pureté de la préparation. Encore ici, si on s'aperçoit qu'une étape ne permet pas l'augmentation de la pureté, il faut alors s'interroger sur sa pertinence. Pour être en mesure de calculer le rendement et la purification, il ne faut pas oublier de mesurer le volume total de la fraction obtenue après chaque étape et d'en prélever des échantillons qui permettront de doser les protéines totales et la quantité de la protéine qu'on cherche à isoler.

La pureté d'une préparation de protéine peut aussi être évaluée selon des critères qualitatifs. Ainsi elle peut être facilement visualisée qualitativement par électrophorèse à haute résolution ou focalisation isoélectrique. Si on n'aperçoit qu'une seule bande protéique, on peut conclure que la préparation ne contient qu'une protéine. Cette évaluation qualitative peut cependant être faussée si la protéine est contaminée par une ou plusieurs autres de même mobilité dans les conditions d'électrophorèse ou de focalisation. Ces techniques permettent aussi de suivre la purification et de voir si le nombre de protéines contaminantes diminue au fur et à mesure du processus pour finir, idéalement, par une seule espèce protéique.


MÉTHODOLOGIE ET APPAREILLAGE

Durant toutes ces étapes, il faut évidemment éviter de dénaturer la protéine qu'on veut isoler. Il faut donc utiliser des milieux dont les caractéristiques sont compatibles avec la stabilité des protéines (pH, force ionique, osmolarité, sels, antioxydants, etc.). Pour cela on fabrique certains milieux plus ou moins "physiologiques", comme le PBS ou le salin, qui possèdent quelques-unes de ces propriétés. Ainsi, le salin (NaCl 150 mM ou 0.85 %) a une osmolarité presque physiologique de 300 mOs. On utilise souvent un tampon destiné à maintenir le pH (généralement aux alentours de 7.4). Le PBS ("phosphate buffered saline") contient un tampon phosphate pH 7.4 et l'osmolarité de la somme de toutes ses composantes est de 315 mOs. Les millieux physiologiques sont discutés dans la section "solutions physiologiques" du SIITUB.

Pour maintenir le pH à un niveau adéquat on inclut généralement un produit tampon dans les solutions. Le phosphate (en mélange mono- et dibasique) est utilisé dans le PBS. Le Tris (trishydroxy-méthyl- aminométhane) est très fréquemment utilisé en raison de son coût peu élevé, même s'il est peu efficace à pH 7.4 et inhibe certaines réactions physiologiques. L'hepes (hydroxyéthyl-pipérazine-éthane-sulfate) est aussi souvent employé. Les qualités et défauts des principaux produits utilisés pour tamponner le pH dans les solutions physiologiques sont discutés dans la section "pHmétrie" du SIITUB.

Il faut aussi éviter de dénaturer les protéines en les exposant à l'air ou en les faisant mousser, ce qui cause une dénaturation et favorise l'oxydation. C'est particulièrement le cas de l'oxydation de la fonction thiol des cystéines en cystines, i.e. formation d'un lien disulfure. Les protéines cytoplasmiques sont particulièrement sensibles car leur milieu naturel, le cytosol, est légèrement réducteur. Elles supportent donc mal leur solubilisation dans le milieu ambiant qui est oxydant. L'emploi d'agents antioxydants comme le ß-mercapto-éthanol ou un des réactifs de Cleland, dithiothréitol ou dithiothréitréol, est souvent recommandé pour protéger ces protéines. Les protéines des compartiments extracellulaires (sang, liquide céphalo-rachidient, etc.) sont beaucoup moins susceptibles à ce problème car ce sont des mileux légèrement oxydants. Les protéines de ces compartiments ne contiennent pas ou très peu de thiols libres mais plutot des liens disulfures.

Quand on travaille avec des protéines en quantités très faibles, il est important d'éviter de contaminer la préparation avec des protéases. Les sources de protéases peuvent être endogènes, présentes dans la préparation même, par exemple dans les lysosomes qui sont brisés lors du broyage des cellules ou par la présence de détergents. Il y a également des sources exogènes, venant de l'extérieur, comme les mains, la salive, etc.

Conservation et rangement des protéines

Les protéines purifiées sont souvent peu stables et doivent généralement être conservées dans des conditions les protégeant de la dégradation. La conservation à basse température est de rigueur. Certaines protéines sont beaucoup plus exigeantes que d'autres et doivent être gardées à -80°C, cependant beaucoup se conservent aux alentours de -20°C. Si les protéines sont stables sous forme sèche (en poudre), c'est la meilleure façon de les conserver. Il est possible aussi de garder des protéines qui se dénaturent durant la congélation dans une solution de glycérol. Cette méthode a l'avantage que le glycérol ne dénature pratiquement jamais les protéines et ne gèle pas aux températures de l'ordre de -20°C. Certaines enzymes peuvent aussi être conservées dans une suspension de cristaux de sulfate d'ammonium. Ces cristaux semblent stabiliser certaines protéines. Il convient aussi d'éviter de répéter des cycles de congélation et de décongélation. La façon la plus commune d'éviter ce problème est de congeler la préparation en petites fractions qui pourront être décongelées une à la fois. Le rangement dans des solutions de glycérol ou des suspensions de sulfate d'ammonium permet aussi d'éviter ce problème puisqu'elles restent liquides à -20°C; mais il faudra probablement se débarasser de ce glycérol ou de ce sulfate d'ammonium pour travailler avec ces protéines

Durant toutes ces étapes, il faut évidemment éviter de dénaturer la protéine qu'on veut isoler. Il faut donc utiliser des milieux dont les caractéristiques sont compatibles avec la stabilité des protéines (pH, force ionique, osmolarité, antioxydant, etc.). Pour cela on fabrique certains milieux plus ou moins "physiologiques", comme le PBS ou le salin, qui possèdent quelques-unes de ces propriétés. Pour maintenir le pH à un niveau adéquat on inclut généralement un produit tampon dans les solutions. Il faut aussi éviter de dénaturer les protéines en les exposant à l'air ou en les faisant mousser, ce qui cause une dénaturation et favorise l'oxydation, particulièrement des cystéines en cystine (i.e. formation d'un lien disulfure). Les protéines cytoplasmiques sont particulièrement sensibles car leur milieu naturel, le cytosol, est légèrement réducteur. Elles supportent donc mal une solubilisation dans le milieu ambiant qui est oxydant. Une oxydation peut non seulement inactiver ou dénaturer les protéines, mais aussi causer leur agrégation si la cystéine d'une protéine forme un lien disulfure avec celle d'une autre protéine. L'emploi d'agents anti-oxydant comme le ß-mercapto-éthanol ou un des réactifs de Cleland (dithiothréitol ou dithiotréitréol) est recommandé pour protéger ces protéines particulièrement sensibles. Ce deux derniers remplacent de plus en plus souvent le ß-mercapto-éthanol, car ils sont beaucoup moins "odorants".

La présence d'EDTA, pour chelater les ions métalliques, peut être utile car ces derniers accélèrent les réactions d'oxydation des protéines. Le travail à basse température,"sur glace", ralentit aussi les processus de dénaturation. Les opérations d'homogénéisation mécanique et de centrifugation sont particulièrement à surveiller, car elles causent souvent une surchauffe de l'extrait.

Quand on isole ou on travaille avec de faibles quantités de protéines, il est important d'éviter de contaminer la préparation avec des protéases. Les sources de protéases peuvent être endogènes, présentes dans la préparation même, par exemple dans les lysosomes} qui sont brisés lors du broyage des cellules. Certains tissus comme le pancréas en contiennent de grandes quantités. Elles peuvent aussi être exogènes, provenant de l'extérieur, comme les mains, la salive, etc. Il existe de nombreuses préparations commerciales d'inhibiteurs ayant des spécificités diverses par rapport au type de protéase. Ces inhibiteurs peuvent être des produits chimiques simples comme l'EDTA qui bloque les métalloprotéases. On retrouve aussi des produits chimiques spécialisés, comme le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) qui inhibe les protéases à sérine. Des inhibiteurs biologiques sont aussi employés, comme la pepstatine, la a2-macroglobuline, etc. On peut même se procurer des mélanges contenant un "cocktail" de divers inhibiteurs.


CALCULS

Tableau de purification

On exprime la pureté d'une préparation de protéines en parlant de son activité spécifique. L'activité est la quantité de la protéine exprimée non pas en termes de poids mais de capacité catalytique ou biologique. L'activité spécifique est l'activité par rapport à la quantité totale de l'ensemble des protéines dans la préparation. Elle est généralement exprimée en unités (enzymatique ou autre) par poids de protéines totales (e.g. 12.34 U/mg de protéines). Plus l'activité spécifique est élevée, plus la protéine est pure. Il est fréquent d'obtenir des facteurs de purifications de l'ordre de 5000 fois et des rendement de l'ordre de 5%.

La concentration des protéines totales est généralement obtenue en dosant les protéines totales d'échantillons récoltés lors des différentes fractions obtenues lors de la purification. On fait de même pour la protéine spécifquement isolée: on mesure la quantité de cette protéine, pas dosage enzymatique s'il s'agit d'une enzyme. Si la protéine n'a aucune activité enzymatique, on peut recourir à des bio-dosages, des eliza, RIA, etc. Pour conaitre la quantité totale de proréines (totales ou d'intérêt) il faut également connaitre le volume de la fraction en question: [ protéines dans la fraction ] * volume de fraction (par exemple mg/mL * mL).

Il est courant de résumer les étapes de purification des protéines par un tableau de purification. Un tableau de purification a l'allure suivante:

Étape
Protéines totales

(mg)

Activité totale

(U)

Activité spécifique

(U/mg protéines)

Facteur de purification
Rendement

(%)

Homogénat initial

600
6000
10.0

1
100

Surnageant

150
3750
25.0
2.5
63

Fraction 20-50% sat. (NH4)2SO4

40
2500
62.5
6.3
42

Chromatographie d'échange ionique

8
2000
250.0
25.0
33

Ce tableau sert à montrer le rôle et l'efficacité de chaque étape dans le processus de purification. Il fait appel à des notions et à des termes précis. Le facteur de purification est le nombre de fois qu'on a pu concentrer l'activité spécifique (par rapport à la première étape) durant chacune des autres étapes de la procédure. Normalement cette valeur est de plus en plus élevée au fur et à mesure des étapes. En effet la purification a justement pour but d'obtenir une protéine de plus en plus pure, ayant donc une préparaion dont l'activité spécifique de plus en plus élevée. Le rendement de la purification est la proportion, en %, de la quantité de la protéine purifiée qui reste par rapport à la quantité initiale. Le rendement diminue à chaque étape puisqu'il est inévitable qu'on ait des pertes de matériel à chacune. Une purification est donc un "compromis" entre le désir d'obtenir une protéine la plus pure possible (facteur de purification élevé) en quantité maximale (rendement élevé). En effet, chaque étape supplémentaire, qui permet d'augmenter la pureté, cause des pertes de matériel, donc diminue le rendement. Au cours d'une purification typique le facteur de purification augmente au fur et à mesure des étapes tandis que, parallèlement, le rendement diminue.

Pour construire un tel tableau, on dose à chaque étape de purification la quantité de protéines totales et l'activité volumique de la protéine en question. Généralement il s'agit d'une enzyme et son activité est exprimée en unités enzymatiques. D'autres unités peuvent servir à définir des protéines sans activité enzymatique. Sachant le volume de chaque fraction, la concentration des protéines totales et l'activité volumique, il devient facile de construire le tableau de purification.

On peut obtenir les valeurs du tableau précédent avec les données suivantes. Pour chacune des fractions qu'on a obtenues lors de la purification, on a mesuré le volume et prélevé des aliquotes pour doser les protéines totales et l'activité de la protéine qu'on voulait isoler. Par exemple, l'homogénat du tableau a un volume de 150 mL et contient 4 mg de protéines/mL et 40 U d'enzyme/mL. Cela permet d'obtenir la quantité de protéines totale (150 mL x 4 mg/mL = 600 mg de protéines totales), l'activité totale (40 U/mL x 150 mL = 6000 U) et l'activité spécifique (6000 U ÷ 600 mg = 10 U/mg). De la même façon on obtient les valeurs des autres fractions. La purification et le rendement se déduisent ensuite facilement. Ainsi pour le surnageant, on peut calculer la purification (25 U/mg ÷ 10 U/mg = 2.5X) et le rendement (3750 U ÷ 6000 U = 62.5%).


Historique

création: 99 04 02

modifications mineures:

04 02 04

RÉFÉRENCES ET BIBLIOGRAPHIE

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K Wilson, J Walker (1994) Principles and techniques of practical biochemistry (4e éd) Cambridge University Press. Oxford.

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Didier Gauthier

Table des matières du SITUUB

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