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99 05 10

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PROTÉINES CHIMÉRIQUES

 

 

Les techniques de génie génétique et de génétique moléculaire permettent des approches expérimentales dans une foule de domaines de la biochimie. Une de ces approches est celle des protéines chimériques (protéines fusionnées, protéines recombinantes) où on associe des gènes de deux ou plusieurs protéines différentes. Dans la plupart des cas, une de ces protéines est celle qu'on veut étudier tandis que l'autre lui confère des propriétés qui la rendent facile à détecter.

Les domaines d'applications sont nombreux. Par exemple, les études des mécanismes moléculaires ont souvent été faites in vitro. On réalise cependant de plus en plus que la cellule est une structure hautement organisée, compartimentée et hiérarchisée. Cette organisation donc est un facteur important pour le fonctionnement correct des molécules qui la constituent. Diverses techniques d'imagerie moléculaires basées sur les protéines chimériques ont donc été développées pour étudier les mécanismes moléculaires in situ dans la cellule.

Protéines fluorescentes et bioluminescentes

Certaines protéines ont la propriété d'être fluorescentes, en particulier la GFP (green fluorescent protein) provenant d'Aequorea victoria, une méduse du nord-ouest du Pacifique. La GFP est une petite protéine de 238 acides aminés ayant une structure en tonneau formée par 11 feuillets-b. Le fluorophore résulte d'une réaction spontanée de cyclisation des chaînes latérales de trois acides aminés à l'intérieur du tonneau. Le principal pic d'absorption est à 395 nm, avec émission à 508 nm. Les conditions physico-chimiques environnantes peuvent cependant en modifier les paramètres de fluorescence. Le gène de cette protéine est disponible depuis le milieu des années 1990. On peut donc recombiner ce gène de la GFP, ou de versions mutantes, avec celui d'une protéine qu'on veut étudier. La protéine chimérique résultante possède donc des propriétés de fluorescence en plus de celles de la protéine étudiée. Si on insère ce gène recombinant dans une cellule, on peut étudier une foule de phénomènes liés à la protéine sous étude. On peut par exemple suivre, au microscope à fluorescence, le déplacement d'une protéine d'un compartiment à l'autre de la cellule. On peut aussi étudier les conditions où la synthèse de la protéine démarre, cesse ou est altérée.

En modifiant un ou quelques acides aminés, on peut changer les propriétés spectrales de la protéine pour la rendre plus facile à utiliser. On a aussi réussi à créer une GFP mutante qui perd sa fluorescence à pH acide. La protéine de fusion résultante cessera donc d'émettre lorsqu'elle entre dans un compartiment acide (golgi, lysosome, etc.).

Même si cette approche est appelée à donner de très nombreuses données, elle a certaines limitations. L'attachement de la GFP sur une autre protéine peut en modifier le fonctionnement. De plus, l'intensité de la fluorescence est susceptible aux conditions physico-chimiques. De plus, au cours de la maturation, la protéine chimérique peut perdre une partie de la structure responsable de la fluorescence.

Une autre de ces protéines est l'obéline . Cette protéine bioluminescente du polype marin Obelia longissima est un complexe constitué d'une apoprotéine, d'un chromophore nommé coelentérazine et d'une molécule d'oxygène. L'intérêt particulier de l'obéline est qu'elle est luminescente seulement en présence de Ca2+. En effet, en présence de ce cation divalent, l'obéline subit une modification structurale qui permet l'oxydation du chromophore qui émet alors de la lumière. Matveev, et al (1999) ont peu produire avec succès une chimère de cette protéine tout en conservant ses propriétés bioluminescentes.


Complexation hélice tétracystéine-As trivalent

On vient de mettre au point une technique où on attache, via gène recombinant, à la protéine étudiée une courte séquence de six acides aminés contenant quatre cystéines. Dans une hélice a, quatre cystéines en positions x, x+1, x+4 et x+5 forment une structure capable de complexer fortement, quoique réversiblement, des atomes d'As trivalents. Si on met en présence une telle protéine avec un produit (fluorophore, chromatophore, etc.) possédant un tel groupe As, le ligand résultant se fixera fortement sur la protéine chimérique, la rendant facile à détecter. On pourrait même baser des méthodes de chromatographie d'affinité.

C'est ce principe qu'ont utilisé Grifffin et al (1998). pour développer la FLASH ("fluorescein arsenical helix"). Ils ont pu ainsi détecter diverses protéines chimériques dans des cellules en culture avec un dérivé dithioarsolanylé de la fluorescéine, un fluorophore souvent utilisé en biologie cellulaire et moléculaire.

Historique

Création: 98 07 24

Additions: 99 05 10

RÉFÉRENCE ET BIBLIOGRAPHIE

BA Grifffin, SR Adams, RY Tsien (1998) Specific covalent binding of recombinant protein molecules inside live cells, Science 281:269-72. [développement de la technique FLASH]

SV Matveev, JC Lewis, S Daunert (1999) Genetically Engineered Obelin as a Bioluminescent Label in an Assay for a Peptide, Anal. Biochem. 270:69-74 [développement de l'emploi de l'obéline].

R Sikorsi, R Peters (1997) "Lighting" Rods, Science 278:1485-6. [commentaires sur des applications potentielles de protéines chimériques à base de GFP]

M Ormö et al (1996) Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein, Science 273:1392-5. [structure de la GFP]

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Didier Gauthier

 

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