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99 05 10

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CHROMATOGRAPHIE DE FILTRATION SUR GEL

 

 

Une autre façon de séparer les molécules est la chromatographie de perméation, plus souvent appelée chromatographie d'exclusion ("gel exclusion chromatography"), gel filtration ou filtration sur gel ou tamisage moléculaire. On emploie surtout les deux derniers termes quand le solvant est aqueux et que la chromatographie se fait sous pression atmosphérique. Divers fabricants vendent des matrices de filtration sur gel: "Sephadex", "Bio-Gel", ToyoPearl, etc. Il est à remarquer que l'usage le plus courant des résines "Sephadex" est bien la filtration sur gel même si un "Séphadex" peut être utilisé comme colonne d'affinité pour les protéines ayant une affinité pour les dérivés du dextran (glucose).

 

PRINCIPES FONDAMENTAUX

La grande popularité de cette technique vient du fait qu'elle peut s'appliquer sur une large gamme de masses moléculaires. La filtration sur gel sépare les molécules selon leur taille, plus spécifiquement leur rayon de Stokes. Cependant, puisque la taille d'une molécule d'une catégorie donnée est généralement proportionnelle à sa masse, cette technique est appliquée à la séparation selon la masse. Cependant, il ne faut jamais oublier que les relations entre le rayon de Stokes, la taille et la masse, sont affectées par de nombreux facteurs. La géométrie de la molécule est un des principaux facteurs. En effet une protéine fibrillaire (allongée) et une protéine globulaire de même masse ne se comporteront pas de la même façon dans un gel. La glycosylation d'une protéine en altère aussi fortement la géométrie. C'est pourquoi la masse des protéines glycosylées est souvent surestimée. L'hydratation, quoique dans une moindre mesure, peut aussi affecter le rayon de Stokes. La présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents, etc., peut aussi modifier le comportement d'une protéine dans une filtration sur gel.

La résine d'un tel gel est constituée de microbilles très poreuses. Le diamètre des pores d'une résine donnée est variable, mais à l'intérieur de certaines limites précises. Certaines molécules seront trop grosses pour entrer dans aucune bille et ne peuvent diffuser qu'à l'extérieur dans le liquide qui les entoure. Elles prendront donc peu de temps pour éluer hors du gel. Au contraire, certaines autres seront suffisamment petites pour diffuser à l'intérieur de toutes les billes en plus de l'espace extérieur. Elles seront retardées et prendront beaucoup plus de temps pour sortir de la colonne. Certaines autres molécules, de taille intermédiaire, pourront entrer dans certains pores de certaines billes. Elles circuleront donc dans une certaine proportion des billes, en plus de l'espace externe. Plus elles seront petites, plus cette proportion sera grande. Elles prendront alors un certain temps (inférieur aux plus petites, mais supérieur aux plus grosses) pour sortir du gel. Ce temps sera donc proportionnel à leur rayon de Stokes, donc indirectement leur taille, donc à leur masse.

Un gel donné a un domaine de fractionnement spécifique (exprimé en termes de masse moléculaire) à l'intérieur duquel les protéines vont prendre, pour sortir du gel, un temps proportionnel à leur taille, donc à leur poids. À l'intérieur de cette marge, les molécules peuvent être séparées les unes des autres. Les molécules plus grosses que la limite supérieure de fractionnement, la limite d'exclusion, vont donc sortir ensemble, assez rapidement. Les molécules plus petites que la limite inférieure sortiront ensemble beaucoup plus tard. Dans ces deux cas il est évidemment impossible de séparer les molécules selon leur masse. Les molécules ayant une masse entre ces deux limites pourront donc être séparées les unes des autres. Ces limites sont appelées domaine de fractionnement.

Il existe plusieurs types de résine ayant des domaines de fractionnement différents selon les besoins qu'on a. Chaque colonne faite avec une résine donnée a donc des caractéristiques différentes. Le lit du gel dans son entier occupe ce qu'on appelle le volume total du gel (Vt qui comprend le liquide à l'extérieur des billes (Vo, souvent appelé volume mort) et celui des billes (Vs ou volume de la phase stationnaire). Comme les billes sont creuses et constituées de pores, une grande partie de leur volume est rempli de solvant, c'est le volume interne (Vi). Le restant du volume ést celui occupé par les fibres du matériel solide constituant le gel (polyacrylamide, dextran, etc.) et qu'on appelle souvent volume du gel (Vg). Cependant, comme Vg est généralement négligeable par rapport au volume interne. Certains auteurs ne font donc même pas cette distinction et considèrent que Vs Å Vi.

Le volume mort constitue la partie du gel dans lequel peuvent diffuser les molécules de taille supérieure au domaine de fractionnement. Les molécules plus petites que la limite inférieure de fractionnement, peuvent donc circuler aussi bien à l'extérieur qu'à l'intérieur des billes, soit dans Vo + Vi (= Vt - Vg Å Vt). Le volume d'élution (Ve) de chacune des molécules entre les deux limites du domaine de fractionnement sera donc quelque part entre Vo et (Vi + Vo). Les coefficients de partition (Kd) et la fraction de diffusion (Kav) se définissent à partir de ces divers volumes.

Déplacement des molécules dans les diverses parties d'un gel de filtration

Les molécules, dépendant de leur taille, pourront, ou non, entrer et diffuser dans les microbilles de la résine. À gauche: particule trop grosse pour pénétrer dans aucun pore. Au centre: particule suffisamment petite pour diffuser dans certaines billes mais trop grosse pour pénétrer dans d'autres. À droite: particule suffisamment petite pour diffuser dans toute la résine.

À l'intérieur du domaine de fractionnement, relation Ve et masse moléculaire est constante sur une base logarithmique (Ve vs log Mr) à condition que la forme des molécules soit similaire. C'est généralement le cas pour la plupart des protéines entre elles. Mais cette similarité n'existe pas, par exemple, entre les polysaccharides et les protéines. Une molécule de polysaccharide est beaucoup plus allongée et planaire qu'une protéine de masse identique, qui est généralement globulaire et relativement compacte. Il faut donc faire attention de calibrer les colonnes de filtration sur gel avec le même type de molécule que les inconnus dont on veut déterminer la masse. Il existe cependant une relation qui est indépendante du type de molécule en introduisant la viscosité des molécules comme facteur de correction. En effet il existe un lien entre la viscosité et la géométrie moléculaire. Ce type de correction n'est cependant pratiquement jamais utilisée dans des filtrations sur gel.

Structure d'un gel de filtration en fonction des différents volumes

 

MÉTHODOLOGIE ET APPAREILLAGE

Principaux gels

Il existe de très nombreuses marques de gels de filtration différents par leur stabilité, résistance à la pression et au débit, etc. On doit aussi comprendre que pour un gel ayant un domaine de fractionnement donné, on peut obtenir des préparations ayant une résolution plus ou moins fine. Les microbilles de faibles diamètres, de l'ordre de 20 mm, permettent d'obtenir une résolution très fine, alors qu'une préparation de billes plus de l'ordre de 200 mm ne permet qu'une résolution grossière.

Résolution des gels de filtration

Deux résines ayant des domaines de fractionnement similaires peuvent donner des résolutions différentes sur des protéines (A et B) ayant des poids rapprochés. Un gel avec de très petites billes (chromatogramme du haut) donne une résolution très supérieure à celles d'un gel composé de billes beaucoup plus grosses (chromatogramme du bas).

C'est pourquoi certaines compagnies vendent des résines de qualités différentes, par exemple "coarse", "medium", "fine", "superfine". Les résines ayant une résolution supérieure ont l'inconvénient d'avoir un débit beaucoup plus lent et d'être beaucoup plus fragiles. De plus, elles sont beaucoup plus dispendieuses. Ces deux caractéristiques limitent évidemment leur emploi à des applications requérant une plus grande précision.

Le Sephadex™ G, de la compagnie Pharmacia, est probablement la plus connue des résines de filtration sur gel. Il est constitué de dextran (un polymère linéaire de glucose) dont les fibres sont réticulées à l'épichlorohydrine pour former les microbilles poreuses. Les différentes variantes (G-25, G-100, G-200, etc.) sont obtenues en contrôlant la réaction de réticulation. Les variantes ont différentes capacités de rétention d'eau, porosités, domaines de fractionnement, limites d'exclusion, etc. Celles ayant des pores plus grands (G-25, G-50, etc.) ont un domaine de fractionnement très réduit, une limite d'exclusion très basse et un débit rapide. Par exemple, la limite d'exclusion du G-25 est de 5000 Da. Elles sont utilisées surtout pour le dessalage. Celles ayant des pores beaucoup plus petits ont un domaine de fractionnement plus élevé. Ainsi le G-200 a une limite de résolution de 600 000 Da. Comme le dextran est très hydrophile, ce gel est utilisé pour les séparations en milieu aqueux. Les variétés de Sephadex ayant une relativement haute limite de résolution sont cependant très fragiles et ne supportent pas des débits ou des pressions hydrostatiques trop élevées.

Le Sephadex LH, toujours de Pharmacia, est un dérivé hydroxypropylé du Sephadex G. Il est stable en présence de solvant organiques purs ou mélangés avec de l'eau.

Le Bio-Gel P est produit par Bio-Rad. C'est un polymère d'acrylamide réticulé avec du bisacrylamide. Encore ici, on peut obtenir différents niveaux de porosité, donc de domaines de fractionnement, en faisant varier les réactifs des réactions de polymérisation et de réticulation. Les différentes variétés de Bio-Gel P, ont des domaines de fractionnement du même ordre que ceux des différentes variétés du Sephadex G. Cette matrice résiste mieux aux pressions hydrostatiques et aux débits élevés.

Le Sephacryl, de Pharmacia, est plus ou moins l'équivalent du Bio-Gel P, sauf qu'il c'est un mélange composite de dextran et d'acrylamide.

Le Sepharose, de Pharmacia, est une préparation d'agarose gélifiée en microbilles et débarrassée de la grande majorité de ses contaminants chargés. La stabilité de cette matrice est due aux liens hydrogène qui lient les polymères d'agarose entre eux. On peut contrôler le domaine de fractionnement en modulant la quantité d'agarose qu'on fait gélifier. Les limites d'exclusion sont extrêmement élevées, souvent de l'ordre du million de Da. Le fait que ce type de gel ne soit pas stabilisé par des liens covalents le rend plus fragile.

Le Bio-Gel A, de Bio-Rad, est plus ou moins l'équivalent du Sepharose.

Le Fractogel TSK, de Pierce, est un polymère de vinyle.

 

Détermination du volume mort et calibrage de la colonne

Il est important de déterminer le volume mort d'une colonne. Pour cela on prend une molécule dont on est sûr que le poids ou le volume rendent impossible son entrée dans les pores du gel. On chromatographie ce produit dans les mêmes conditions que celles qui serviront à l'échantillon: dimension de la colonne, débit, pression, etc. Normalement ce calibrage se fait en même temps que celui des étalons de masse moléculaire. Le bleu de dextran, un polysaccharide de Mr de quelques millions et ayant une couleur bleue facile à suivre lors de l'élution, est le plus souvent utilisé.

Pour calibrer une colonne, il suffit de chromatographier des protéines de poids moléculaire connu dans la colonne. On note le volume d'élution de chaque étalon. Cela permet de construire une courbe Mr vs Kav. On peut aussi le Ve au lieu du Kav, dans ce cas, la courbe de calibrage n'est bonne que pour cette colonne et dans les conditions identiques de chromatographie. Une fois calibrée, la colonne peut être employée pour déterminer la masse moléculaire d'un ou plusieurs inconnus. Cet inconnu devra être chromatographié sur la même colonne dans les mêmes conditions (solvant, débit, pression hydrostatique, etc.). En reportant sur la courbe le Kav ou le Ve de l'inconnu, on peut facilement en calculer la masse moléculaire. La linéarité de la relation Mr vs Kav ou Mr vs Ve n'existe qu'à l'intérieur de certaines limites de masse. C'est pourquoi il faut utiliser que la portion linéaire de cette courbe  

APPLICATIONS À LA BIOCHIMIE

Il existe deux grands types d'application des filtrations sur gel couramment utilisé en biochimie: les séparations de groupe, pour obtenir une séparation grossière, et le fractionnement moléculaire pour une séparation fine.

La séparation de groupe consiste à séparer les petites molécules des grosses, en deux groupes distincts: les grosses molécules qui sortent dans le volume mort et les autres qui sortent plus tard. Ainsi, la filtration sur gel peut servir au "dessalage" de solutions: séparation brute des protéines d'une solution des molécules de petit poids moléculaire comme les sels (d'où le terme "dessalage"), sucres, acides aminés, etc. Dans ce cas on utilise une résine ayant un petit domaine de fractionnement où toutes les protéines iront dans le volume mort tandis que les sels et autres petites molécules pourront entrer dans les pores du gel. Il est alors facile de recueillir le volume mort contenant les protéines débarrassées des petites molécules.

Dans le fractionnement moléculaire, on sépare un mélange complexe (généralement de protéines) en plusieurs fractions de poids moléculaire spécifique. Le principal usage de ce type de procédure est la détermination de la masse moléculaire des protéines, ce qui est une application "analytique". C'est une technique assez précise qui permet de travailler sur des molécules non dénaturées et possédant encore leur structure quaternaire.

On peut aussi se servir du fractionnement moléculaire pour purifier une protéine donnée, ce qui est donc une application "préparative".

 

Dessalage

On peut facilement séparer les macromolécules d'une solution par dessalage. On prend un gel ayant une limite d'exclusion très basse qui permettra seulement de laisser pénétrer les petites molécules mais pas les macromolécules. Avec une résine ayant un débit rapide (limite de résolution basse, qualité de résolution grossière), on peut donc rapidement recueillir le volume mort, où sont restées les macromolécules.

On se sert de cette technique pour éliminer des contaminants (sels, détergents, etc.) d'une préparation. Cette approche peut avantageusement remplacer la dialyse, elle est beaucoup plus rapide mais nécessite un peu plus de manipulations et un suivi constant.

Du côté industriel, on peut produire du lait sans lactose, pour les personnes intolérantes à ce produit, en dessalant du lait. Évidemment, dans ce cas on utilise des colonnes de taille industrielle.

 

Détermination du poids moléculaire

Les gels de filtration sur gel sont abondamment utilisés en biochimie pour déterminer le poids moléculaire des protéines. Cette technique est généralement très fiable même si elle est relativement simple d'exécution. Elle a remplacé la centrifugation analytique dans ce genre d'application. Elle nécessite évidemment l'emploi d'une colonne de gel de haute qualité et très soigneusement calibrée.

 

Purification de protéines

Comme toutes les chromatographies, la filtration sur gel peut servir comme une étape de la purification d'une protéine. Pour ce faire, il faut utiliser une résine de haute qualité permettant une résolution maximale. Les filtrations sur gel sont souvent la dernière étape d'une purification de protéines car, pour être efficaces, elles nécessitent une préparation relativement "propre" ayant un petit volume.

 


 ASPECTS TECHNIQUES

Colonnes et échantillons

Les dimensions du lit de la colonne et le volume de l'échantillon varient selon le but de la filtration sur gel. Le lit de la colonne doit être relativement long pour une détermination de Mr ou une purification, afin d'obtenir une résolution maximale. Idéalement la hauteur devrait être de l'ordre de 100 cm avec un petit diamètre, 1 à 2 cm). Évidemment dans ces conditions, le débit est passablement lent. L'échantillon doit aussi être minime en termes de volume. Il est généralement de l'ordre du centième de celui du lit de la colonne

Pour le dessalage, la résolution est beaucoup moins critique. On utilise des colonnes beaucoup plus courtes, c'est la rapidité qui est recherchée. On peut tolérer des volumes d'échantillon qui vont jusqu'à 10 à 20% du lit de la colonne

 

Élution

Le débit doit être très stable et lent si on veut obtenir une bonne résolution. On peut utiliser des dispositifs plus simples comme des vases de Mariotte. Il est cependant plus courant d'utiliser des pompes péristaltiques.

Les résines de filtration sur gel sont plutôt fragiles, particulièrement celles ayant une limite d'exclusion élevée car elles ont une grande porosité. Les vitesses de débit et les pressions hydrostatiques doivent donc être soigneusement contrôlées pour éviter que les billes du gel éclatent. Comme les pompes péristaltiques peuvent développer des pressions assez fortes, on doit utiliser ces appareils avec précaution.

Les filtrations sur gel peuvent se faire sans problème à température de la pièce. Cependant, elles se font souvent à 4°C, dans une chambre froide ou un réfrigérateur à chromatographie, pour éviter la dégradation des protéines. C'est évidemment le cas lors de la purification de protéine où la stabilité des protéines est cruciale.


 

Historique

Création: 99 05 10

RÉFÉRENCE ET BIBLIOGRAPHIE

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K Wilson, J Walker (1994) Principles and techniques of practical biochemistry (4e éd) Cambridge University Press. Oxford.

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Didier Gauthier

SIITUB

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