27 fév 04
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PRINCIPES DE BASE
La centrifugation est une méthode couramment utilisée en biochimie pour séparer ou analyser des fractions ou des structures cellulaires, des macromolécules, etc.
On peut accentuer ou raffiner les méthodes de séparation en faisant cette centrifugation dans un gradient de concentration. En effet, un des facteurs qui influence la vitesse de sédimentation est la différence entre la densité de la particule et celle du solvant. On peut donc moduler cette vitesse en faisant varier de façon continue ou par étape (discontinue) cette différence de densité en créant un gradient de concentration.
Si la densité de la particule est plus grande que celle du milieu, elle sédimentera. Plus la différence de densité est grande plus la sédimentation est rapide. S'il n'y a aucune différence de densité, il n'y aura aucune sédimentation, quelle que soit l'accélération. Si la particule est moins dense que celle du milieu, celle-ci s'élèvera dans le tube jusqu'à atteindre un niveau de densité égal à la sienne ou, le cas échéant, jusqu'à flotter à la surface.
MÉTHODES ET APPAREILLAGE
Fabrication des gradients
Les variations de densités sont obtenues en faisant varier la concentration d'un produit chimique dans la solution. Divers produits peuvent être utilisés pour faire ces gradients. Ils doivent être très solubles en solution aqueuse, ce qui permet d'obtenir des densités suffisantes. On recherche aussi des produits qui sont relativement inertes, peu coûteux, faciles à manipuler, non toxiques, etc. Évidemment aucun produit ne réunit toutes ces qualités et on doit choisir en tenant compte des contraintes expérimentales
Le saccharose ("sucrose") est très souvent employé. Il permet d'atteindre des densités assez élevées, de l'ordre de 1.3 g/mL avec du saccharose 2.5 M. Ce produit a l'avantage d'être peu coûteux, électriquement neutre et plutôt inerte pour la plupart des fractions cellulaires. Son principal défaut est sa viscosité à forte concentration, ce qui rend son utilisation plus difficile. Il est aussi à déconseiller si la pression osmotique est un facteur important, par exemple dans l'isolement de cellules entières.
Un autre produit couramment utilisé, particulièrement dans la séparation des acides nucléiques, est le chlorure de césium (CsCl). Ce sel peut atteindre une densité très élevée, de l'ordre de 1.9 g/mL à 7.5 mol/L. Cette possibilité d'atteindre des densités si élevées en solution aqueuse est son principal avantage. Son coût et le fait qu'il s'agisse d'un sel, donc de molécules chargées, réduisent son champ d'application. D'autres sels de césium peuvent aussi être employés comme le CsSO4.
D'autres produits peuvent aussi être utilisés pour séparer des cellules ou des organites par gradient de densité. Cependant, ils sont souvent restreints à des applications particulières. Leur coût peut aussi être prohibitif.
Le Metrizamide™, de la compagnie Nyegard, est un dérivé iodobenzamido du glucose. Il est très soluble et non chargé. Il permet d'atteindre des densités assez fortes de l'ordre de 1.46 et, principal avantage sur le saccharose, il est relativement peu visqueux. Cependant, son coût, sa forte absorption dans l'UV, son instabilité (pH supérieur à 8, lumière. températures supérieures à 55°C) limitent son emploi.
Le Ficoll™, un produit de la compagnie Pharmacia, est un polymère de glucose l'épichlorohydrine, comme le Sephadex™ de la même compagnie. Son principal avantage est qu'il peut produire des densités élevées sans générer de fortes pressions osmotiques. Il est cependant restreint à certains usages précis, surtout la séparation de cellules entières, à cause de son coût, de sa grande viscosité et des densités limitées qu'il permet d'atteindre.
Notons enfin le Percoll™, un autre produit de Pharmacia. Il s'agit ici de particules de gel de silice recouvertes de polyvinylpyrolidone. Il permet de produire des densités de l'ordre de 1.3 g/mL tout en maintenant de faibles pressions osmotiques et de faibles viscosités, en plus de pouvoir être stérilisé à répétition. Ces qualités en font le produit de choix pour du travail d'isolement des cellules entières. Son coût, les faibles densités qu'il permet d'atteindre limitent son emploi à ce genre d'applications.
Gradients continus et discontinus
On peut faire des gradients discontinus en juxtaposant un par-dessus l'autre des solutions ayant des différences suffisantes de densités. On obtient ainsi des gradients discontinus. On peut facilement fabriquer des gradients discontinus en déposant une sur l'autre deux ou trois couches de solutions de diverses densités.
On peut aussi obtenir des gradients continus où la variation de densité est graduelle le long du tube à centrifuger. Cette variation graduelle peut linéaire, exponentielle (concave), logarihtmique (convexe), etc.
Séparation isopycnique en gradient continu
Dans ce type de méthode, les molécules soumises à la centrifugation sur le gradient se sépareront selon leur densité, non pas leur masse. La préparation à analyser est déposée sur le sommet du gradient, puis on centrifuge à équilibre. Chaque type de particule sédimentera jusqu'à ce qu'elle atteigne la concentration correspondant à sa densité. Elle s'immobilisera alors à ce niveau. Il est même possible de faire des gradients générés durant la centrifugation elle-même, sous l'influence directe du champ gravitationnel.
Certains auteurs semblent restreindre le terme "isopycnique" uniquement aux gradients auto-générés. Cependant ce terme s'applique à tous les cas où on centrifuge à équilibre dans un gradient continu.
Séparation zonale en gradient continu
La centrifugation peut aussi être utilisée pour des fins analytiques, pour séparer des particules ou des molécules, selon leur taille. Dans ce type d'applications, comme les particules sont homogènes, elles ont toutes la même densité, elles ne diffèrent que par leur taille. Le gradient sert donc à faire en sorte que les particules lourdes sédimentent plus vite que les plus légères, tout en n'atteignant jamais le fond du tube à centrifuger. On ne centrifuge donc pas à équilibre. Le gradient, dont la concentration maximale est moins dense que les particules, ne sert qu'à ralentir la sédimentation. On arrête donc la sédimentation quand les plus lourdes sont rendues vers le bas du tube à centrifuger et que le niveau désiré de séparation est obtenu. Pour optimiser la séparation, on peut utiliser diverses formes de gradient (linéaire, convexe, concave).
Rotors
Il existe deux types de rotors utilisables pour les gradients continus ou discontinus: à godets mobiles ou verticaux. Les rotors à angle fixe ne sont pas normalement pas utilisables pour ce type d'application.
Les rotors à godets mobiles se réorientent lors de la centrifugation. En effet, les godets sont disposés sur des crochets ou un système à bascule. Quand la rotation du rotor débute les godets (et les tubes qu'ils contiennent), sous l'effet de la force centrifuge, se réorientent et passent en position horizontale. Les particules peuvent donc sédimenter directement dans le fond du tube sans jamais heurter les parois du tube. Le principal inconvénient de ce type de rotor est qu'il ne peut pas atteindre des vitesses très élevées. En effet, les godets en position horizontale allongent énormément le rayon du rotor, ce qui rend plus difficile de lui imprimer des vitesses de rotations élevées. Ce genre de rotor est utilisé principalement dans les centrifugations en gradients discontinus ou continus.
Dans les rotors verticaux, ce sont les gradients eux-mêmes qui se réorientent, les tubes eux demeurent toujours verticaux. Tout comme les rotors à angle fixe, les rotors verticaux sont des blocs de métal résistant (aluminium, titane) dont les puits destinés à contenir les tubes sont tout à fait verticaux. Lors de l'accélération le gradient contenu dans le tube se réarrange et prend une orientation horizontale, perpendiculaire à l'axe de rotation. Les particules passeront donc à travers ce gradient. Lorsque la centrifugation cesse, le gradient se réarrange encore, repasse en position verticale dans l'axe du tube, parallèle à l'axe. Le grand avantage de ce type de rotor est que sa forme compacte permet de le faire tourner à des vitesses beaucoup plus grandes que des rotors à godets mobiles. Cela réduit énormément la durée de la centrifugation ou permet d'exécuter des protocoles de centrifugation difficilement réalisables autrement.
Migration en gradient dans différents types de rotor
Migration des particules de différentes densités dans des gradients continus selon le type de rotor. A) Disposition avant la centrifugation. B) Disposition au tout début de la centrifugation. C) Disposition dans les dernières minutes de la centrifugation. D) Disposition après l'arrêt de la centrifugation. Remarquez que la position finale des particules et l'orientation des gradients sont identiques à la fin de la centrifugation, indépendamment du type de rotor.
APPLICATION À LA BIOCHIMIE
Purification de fractions cellulaires en gradient discontinu
On peut purifier de façon de simple des fractions cellulaires en mettant à profit un autre critère de centrifugation: la différence de densité entre la particule et celle du milieu. En effet, certaines particules ou organites cellulaires ont des densités différentes. On peut donc les isoler, ou s'en débarrasser, par centrifugation à équilibre. En choisissant bien les densités de ces couches, la fraction cellulaire qu'on veut isoler se localisera sur la couche qui a une densité plus forte. Les autres fractions, ayant des densités différentes, sédimenteront plus bas ou seront immobilisés plus haut.
Les mitochondries peuvent être séparées des noyaux avec ce type d'approche.
Un autre exemple typique est la séparation des polyribosomes libres et membranaires du reste des fractions cellulaires. Les polyribosomes libres sont plus denses que du saccharose 2.0 M. Par contre, les polyribosomes attachées aux membranes du réticulum endoplasmique rugueux flottent sur ce même saccharose 2.0 M. Les membranes du réticulum endoplasmique lisse, qui flottent sur du saccharose 1.0 M. En utilisant un gradient à trois étages, saccharose 0.25 M, contenant la préparation cellulaire, 1.0 et 2.0 M, on peut facilement séparer les polyribosomes libres ou membranaires.
Analyse des patrons de sédimentation par centrifugation zonale
Une application classique de cette approche est l'analyse de la taille des polyribosomes, le profile de sédimentation. Dans ce cas-ci, on prépare des gradients continus de saccharose (généralement de 10-20% à 30-40%p/p) dans des tubes à centrifuger. La préparation de ribosomes est déposée au sommet de ce gradient. Après une centrifugation, les polyribosomes auront sédimenté proportionnellement à leur masse.
Séparation isopycnique de macromolécules
Différents types d'ADN peuvent être séparés par centrifugation isopycnique sur un gradient de CsCl.
création: 98 04 28
additions: 98 04 05
04 02 27
RÉFÉRENCES ET
BIBLIOGRAPHIE
RF Boyer (1993) Modern experimental biochemistry, Addison-Wesley Publishing Company, Reading (USA).
RMC Dawson, DC Elliot, WH Elliot, KM Jones (1986) Data for biochemical research, Clarendon Press, Oxford, p.545-9. [données physico-chimiques et techniques sur le matériel utilisé dans la fabrication de gradient de densité]
RL Dryer, GF Lata (1989) experimental biochemistry, Oxford Univesity Press, Oxford
P Kamoun (1977) Appareils et méthodes en biochimie, Flammarion, Médecine-Sciences, Paris.
DT Plummer (1987) An introduction to practical biochemistry (3e édition), McGraw Hill Book Co., London.
Didier Gauthier
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