14 jun 04
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Les phénomènes biochimiques sont très influencés par les conditions externes comme la température, le pH, les conditions ioniques, etc. Si on veut les étudier in vitro, il est évidemment important de les comprendre pour identifier et les contrôler.
PRINCIPES DE BASE
Le pH doit être maintenu pour que les fonctions biologiques qu'on étudie soient préservées. S'il s'agit de cellules animales entières intactes, on garde le pH à 7.4 qui est celui du milieu extracellulaire. S'il d'agit d'organite, on maintiendra le pH au même niveau que celui du cytosol de la cellule. Cette valeur est normalement autour de la neutralité à la température où vit cette cellule. Il faut aussi se rappeler que l'intérieur de certains compartiments, comme les lysosomes, le golgi, etc., est relativement acide, autour de pH 4.
Il est important, surtout si on travaille avec des cellules entières, de maintenir une pression osmotique normale. Une solution hypotonique (osmolarité trop faible) risque de faire éclater les cellules sans paroi rigide, en provoquant une entrée massive d'eau par osmose. Une solution hypertonique aura aussi des effets néfastes. Pour les cellules mammaliennes la valeur normale est de 300-320 mOs. On doit aussi essayer de reproduire les conditions ioniques. La présence d'autres facteurs comme les acides aminés, vitamines, glucose, etc. est essentielle dans les cultures à long terme.
APPAREILS ET METHODOLOGIE
pH
Le pH est maintenu par un produit tampon. Les défauts des principaux produits couramment utilisés (phosphate, CO2/bicarbonate, tris) sont bien connus et ont été discutés ailleurs (voir section pH et pHmétrie).
Dans la culture de cellules mammaliennes, on emploie souvent un indicateur coloré de pH qui aide à visualiser instantanément si le pH s'est trop acidifié. Généralement, on emploie le rouge de phénol qui devient jaune sous pH 7 alors qu'il est rouge au dessus. Évidemment ce produit n'est pas toxique pour les cellules.
Osmolarité et osmométrie
Il est courant de mesurer l'osmolarité des milieux qu'on fabrique. On utilise habituellement un osmomètre. La plupart des osmomètres disponibles sur le marché mesurent l'osmolarité d'une solution en déterminant la diminution du point de fusion d'une solution par rapport à l'eau pure; en effet, il y a une proportionnalité directe entre cette diminution et l'osmolarité.
On utilise souvent du saccharose ("sucrose") pour maintenir l'osmolarité. Ce produit n'entre pas dans les cellules animales intactes et n'est pas toxique, en plus il physiologiquement inerte, non chargé, peu coûteux et très soluble. C'est la principale raison de sa présence (souvent à 250 mM) dans beaucoup de solutions tampons physiologiques. On peut aussi utiliser du NaCl qui est le principal sel des fluides corporels. Cependant, pour obtenir une osmolarité physiologique, il faut 300 mM de NaCl. Cette concentration est peu physiologique car elle est très supérieure à la concentration dans les fluides corporels, généralement autrour de 110 mM.
Stérilisation
La culture de cellules ou de bactéries exige l'emploi de milieu stérile. On peut stériliser à l'autoclave ou par ultrafiltration ("stérilisation froide").
La procédure à l'autoclave exige d'exposer le liquide à des températures de l'ordre de 120 °C sous une pression de 15 psi ("pound per square inch") durant au moins 20 minutes. La solution doit ètre directement en contact avec la vapeur. Si le liquide est dans une bouteille, on prendra soin de laisser le bouchon à demi vissé pour faciliter l'entrée de la vapeu dans la bouteille pour maximiser le contact. Evidemment, à lorqu"on récupère la bouteille, on doit refermer hermétiquement le bouchon pour empêcher que le liquide se recontamine. Cette méthode a toutefois quelques défauts. Tout d'abord, l'exposition de certains composés à de telles conditions de température et de pression peut les détruire. L'acide aminé glutamine est particulièrement sensible. De plus, ces conditions peuvent aussi provoquer des réactions indésirables entre certains produits. C'est notamment le cas du glucose (et des monosaccharides en général) et des fonctions amines primaires, c'est la réaction de Maillard. Enfin, la précipitation de certains sels, comme le phosphate de magnésium, peut être accentuée lors de l'autoclavage. Evidemment on peut résoudre ces problèmes en évitant de stériliser les composés problématiques avec le reste de la solution. Cela introduit cependant des étapes supplémentaires dans la préparation des solutions.
La stérilisation par ultrafiltration consiste à filtrer le liquide avec une membrane de 0.45, ou encore mieux, de 0.22 mm. Divers dispositifs permettent de soumettre des volumes très petits ou très grands à ce processus. Un des ennuis qu'on retrouve souvent est que ces filtres de très petite porosité se bloquent très souvent. Une solution est de pré-filtrer les solutions avec des filtres à grande porosité et de forte capacité.
création: 98 04 02
modiifcations mineures: 98 04 02, 99 04 05
additions 14 06 04
APPLICATIONS A LA BIOCHIMIE
Voici une liste des principales solutions physiologiques utilisées en biochimie.
Le PBS ("phosphate buffered saline") contient un tampon phosphate pH 7.4 et le NaCl est le principal ion maintenant la pression osmotique. Son osmolarité est de 315 mOs.
Les diverses variantes des solutions de Krebs et Ringer ont été développées pour imiter les concentrations des composantes ioniques du sérum.
D'autres solutions salines équilibrées ont été développées pour permettre le maintien à long terme de divers types de tissus mammaliens, amphibiens ou autres.
RÉFÉRENCES ET
BIOBLIOGRAPHIE
RMC Dawson, DC Elliot, WH Elliot, KM Jones (1986) Data for biochemical research, Clarendon Press, Oxford, p.446-48. [recettes de diverses solutions de Krebs et Ringer, solutions salines équilibrées, eau de mer artificielle, etc.]
Didier Gauthier
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